Під редакцією Пітера Сарнова, Медична школа Стенфордського університету, Стенфордський університет, Каліфорнія, затверджено 25 грудня 2020 р. (переглянуто 25 жовтня 2020 р.)
Ми повідомляємо про взаємодію між субодиницями в реплікації комплексів транскрипції коронавірусів, які є важливими для реплікації та еволюційного збереження.Ми надали докази того, що домен NiRAN, пов’язаний з nsp12, має нуклеозидмонофосфатну (NMP) трансферазну активність у трансі, і визначили nsp9 (білок, що зв’язує РНК), як його мішень.NiRAN каталізує ковалентне приєднання фрагмента NMP до консервативного амінокінця nsp9 у реакції, яка базується на іонах Mn2+ і суміжних консервативних залишках Asn.Було виявлено, що активність NiRAN і NMP-піляція nsp9 важливі для реплікації коронавірусу.Ці дані дозволяють нам пов’язати цю активність ферментного маркера вкладеного вірусу з попередніми спостереженнями в рамках гіпотези про те, що початок синтезу РНК у класі РНК-вірусів є функціонально та еволюційно послідовним.
РНК-залежна РНК-полімераза (RdRps) Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae та 12 інших родин) пов’язана з аміно-кінцевим (N-кінцевим) доменом у неструктурному білку (nsp), який вивільняється з поліпротеїну, який називається NiRAN 1ab складається з вірусної головної протеази (Mpro).Раніше повідомлялося про власну активність артеріального вірусу NiRAN-RdRp nsp GMPylation/UMPylation, і було запропоновано створити перехідний процес для перенесення нуклеозидмонофосфату (NMP) до (наразі невідомого) вірусу та/або клітинної біополімеризації Things.Тут ми показуємо, що коронавірус (коронавірус людини [HCoV]-229E та коронавірус 2 важкого гострого респіраторного синдрому) nsp12 (NiRAN-RdRp) має Mn2+-залежну NMP-пілюючу активність, яка походить від nsp9 шляхом утворення Mpro-опосередкованого nsp9 після N-кінець, що фланкує nssp, вивільняється протеолітично, фосфорамідат зв’язується з первинним аміном (N3825) на N-кінці nsp9.Уридинтрифосфат є кращим нуклеотидом у цій реакції, але аденозинтрифосфат, гуанозинтрифосфат і цитидинтрифосфат також є придатними ко-субстратами.Дослідження мутацій з використанням рекомбінантних білків nsp9 і nsp12 коронавірусу та генно-інженерних мутантів HCoV-229E визначили залишки, необхідні для NiRAN-опосередкованої NMP-піляції nsp9 і реплікації вірусу в культурі клітин.Дані підтвердили передбачення залишків активного центру NiRAN і визначили важливу роль залишків N3826 nsp9 у NMP-піляції nsp9 і реплікації вірусу in vitro.Цей залишок є частиною консервативної N-кінцевої трипептидної послідовності NNE і виявився єдиним інваріантним залишком nsp9 та його гомологів у родині коронавірусу.Це дослідження забезпечує надійну основу для функціонального вивчення активності NMP-пілування інших вкладених вірусів і пропонує можливі мішені для розробки противірусних препаратів.
Вірус позитивної ланцюга РНК Nidovirales інфікує різноманітних хребетних і безхребетних (1, 2).Порядок наразі включає 14 сімей (3), з яких родина Коронавірусу ретельно вивчалася протягом останніх 20 років.У той час три зоонозні коронавіруси виникли від тварин-господарів і спричинили масштабні спалахи важких респіраторних інфекцій у людей.У тому числі стійкі пандемії, викликані важкими гострими інфекційними захворюваннями.Коронавірус респіраторного синдрому 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Нідовіруси мають загальну організацію геному, і субодиниця пов’язаного з мембраною реплікаційно-транскрипційного комплексу (RTC) закодована в 5-?²-термінальній двох третинах і основній структурній субодиниці вірусної частинки, а також деякі аксесуари .Білок, закодований у 3??² кінцевій третині геному (1).За винятком однієї родини планаріїв (Monoviridae) (8), усі вкладені віруси кодують субодиниці RTC у двох великих відкритих рамках зчитування (ORF) ORF1a та ORF1b, які транслюються з геномної РНК.ORF1a кодує поліпротеїн (pp) 1a, а ORF1a і ORF1b спільно кодують pp1ab.За загальної участі основної протеази (Mpro), кодованої ORF1a, як pp1a, так і pp1ab протеолітично процесуються в різноманітні неструктурні білки (nsps), також відомі як 3CLpro, оскільки він має гомологію з 3Cpro пікорнавірусу ( 9).Вважається, що ці nsps збираються у великий динамічний RTC, каталізують синтез геномної РНК (реплікація) і набору субгеномної РНК (транскрипція) і використовуються для координації експресії ORF, розташованої нижче за ORF1b (10?? ?12).
Основний RTC включає РНК-залежну РНК-полімеразу (RdRp) (13), геліказу надродини 1 (HEL1) (14, 15) і кілька ферментів обробки РНК, які в основному кодуються в ORF1b і сімействі коронавірусів. Він містить nsp12-nsp16 і nsp9-nsp12 у родині Arterioviridae (див. посилання 10–12).RdRp і HEL1 представляють два (одну п'яту) консервативних доменів вірусу пташиного гнізда і мають гомологію з іншими РНК-вірусами.Вважається, що корова репліказа підтримується іншими субодиницями, включаючи кілька невеликих nssp, що вивільняються з карбокси-кінцевої (C-кінцевої) області pp1a, нижче Mpro (коронавірус nsp5 і артеріальний вірус nsp4, відповідно).Вони мають обмежений захист, пов’язаний із сім’єю, і різноманітні види діяльності (переглянуто в посиланні 10ââ12).
Відносно нещодавно домен з унікальними характеристиками мотиву послідовності був знайдений на амінокінці (N-кінці) поруч із RdRp у всіх вкладених вірусах, але не в інших РНК-вірусах (16).На основі його розташування та активності нуклеотид-трансферази (нуклеозидмонофосфат [NMP] трансферази) цей домен називається NiRAN (пов’язана з Nestvirus RdRp нуклеотидна трансфераза).Дводоменна комбінація NiRAN-RdRp становить nsp12 у сімействі Coronaviridae та nsp9 у родині Arterioviridae, а в інших nestoviridae очікується, що NiRAN-RdRp вивільнятиметься як незалежний nsp із вірусного поліпротеїну.У коронавірусі домен NiRAN містить ??1/450 залишків і з’єднаний із C-кінцевим доменом RdRp через лінкерну область (16–19).У вірусі артеріїту коней (EAV) (Arteriviridae) рекомбінантний nsp9 демонструє залежну від іонів Mn2+ (самостійну) активність UMP- і GMP-піляції, яка залежить від трьох консервативних основ послідовності в нестовірусі, залишків AN, BN і CN у послідовності.Де N означає NiRAN) (16).N-кінцеве фланкування цих мотивів є менш консервативним мотивом preAN.Деякі з цих залишків також зберігаються у віддалено споріднених протеїнкіназах, де вони, як було показано, беруть участь у зв’язуванні та каталітичній активності нуклеозидтрифосфату (NTP) (20, 21).Згідно з цим спостереженням, кілька ключових залишків активного сайту в псевдокіназі SelO з Pseudomonas syringae можна зібрати за допомогою нещодавно опублікованого суперкомплексу SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13.Консервовані залишки NiRAN від коронавірусу, накладені в електронну мікроструктуру.Рекомбінантний білок (17).Існує припущення, що задокументована (само) U/GMPіляція призведе до перехідного стану для перенесення NMP на (наразі невідомий) субстрат (16), а структурна подібність між NiRAN і протеїнкіназою (17, 19) ) Чи є гіпотеза, що NiRAN модифікує інші білки.
Раніше називали три можливі функції, що включають NiRAN для регулювання геномної/субгеномної трансляції або реплікації/транскрипції.Зважаючи на обмежені та неповні дані, доступні на той час, кожна функція має свої переваги та недоліки (16).У цьому дослідженні ми прагнемо поєднати біохімічні та зворотні генетичні дослідження коронавірусів, що представляють два роди, і поставити наші висновки на еволюційний фон природної мутації сімейства коронавірусів, щоб отримати розуміння цього Таємничого царства.Ми повідомляємо про значні успіхи в розумінні NiRAN завдяки ідентифікації природних мішеней у RTC, що (серед трьох доступних гіпотез) сприяє ролі цього домену в ініціації синтезу вкладеної вірусної РНК.Це дослідження також відкриває можливості для інших ролей NiRAN в інтерфейсі хоста вірусу.
Щоб охарактеризувати ферментативні властивості домену NiRAN, пов’язаного з вірусом корони nsp12, ми виготовили рекомбінантну форму коронавірусу людини 229E (HCoV-229E) nsp12 в E. coli з міткою His6 на С-кінці та об’єднали білок з [α32-P] Інкубуйте разом з NTP у присутності MnCl2, як описано в матеріалах і методах.Аналіз продукту реакції вказав на присутність радіоактивно міченого білка, який мігрує разом з nsp12 (106 кДа), що вказує на те, що nsp12 коронавірусу каталізує утворення ковалентних адуктів білок-NMP, переважно утворених з уридинмонофосфатом (UMP) (рис. 1A) і Б).Кількісний аналіз показав, що порівняно з іншими нуклеотидами інтенсивність сигналу включення UMP зросла в 2-3 рази (рис. 1C).Ці дані узгоджуються з прогнозованою NMP-трансферазною активністю домену NiRAN коронавірусу (16), але вказують на те, що переваги нуклеотидів домену NiRAN коронавірусу та артеріального вірусу відрізняються.
Активність самопілювання HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 кДа) інкубували з визначеним [α-32P] NTP у присутності 6 мМ MnCl2 протягом 30 хвилин (докладніше див. Матеріали та методи).Продукти реакції розділяли за допомогою SDS-PAGE і фарбували кумасси діамантовим синім.(B) Мічений радіоактивним ізотопом білок візуалізується за допомогою фосфорної візуалізації.Позиції nsp12-His6 і маркерів молекулярної маси білка (у кілодальтонах) показані в A і B. (C) Інтенсивність радіоактивного сигналу (середнє значення ± SEM) було визначено з трьох незалежних експериментів.*P≤0,05.Потужність сигналу (у відсотках) пов’язана з UTP.
Незважаючи на те, що пов’язана з NiRAN ферментативна активність виявилася важливою для реплікації EAV та SARS-CoV у клітинній культурі (16), конкретна функція NiRAN та потенційні мішені ще не визначені.Нещодавно повідомлена структурна подібність між NiRAN і сімейством білків з протеїнкіназоподібними складками (17, 22) спонукала нас перевірити гіпотезу про те, що NiRAN каталізує NMP-пілування інших білків.Ми створили набір потенційних гомологічних мішеней, включаючи неструктурні білки, кодовані HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), кожна з яких містить C-кінцевий тег His6 (додаток SI, таблиця S1) і інкубуйте ці білки з [α32-P] уридинтрифосфатом ([α32-P]UTP) у присутності або відсутності nsp12.Бичачий сироватковий альбумін і злитий білок MBP-LacZα, вироблені в E. coli, служили контролем (Рис. 2A, доріжки 1-7).Мічений радіоактивним ізотопом білок аналізували за допомогою електрофорезу в додецилсульфаті натрію в поліакриламідному гелі (SDS-PAGE) і авторадіографії, і було виявлено, що в реакції, що містить nsp12 і nsp9, був сильний радіоактивний сигнал.Положення сигналу відповідає молекулярній масі nsp9, що вказує на опосередковану nsp12 UMPіляцію nsp9 (рис. 2B, доріжка 7).Не було виявлено жодних інших досліджуваних білків, які були б UMPiled, що змусило нас зробити висновок, що nsp9 є специфічним субстратом nsp12.Consistent with the self-NMPylation data shown in Figure 1, nsp12 is able to transfer all four NMPs to nsp9, although the efficiency is different, UMP> adenosine monophosphate (AMP)> guanosine monophosphate (GMP)> cytidine monophosphate (CMP) ) ( Картина).3 А і Б).Under the conditions used in this assay (shorten the reaction and exposure time, reduce the concentration of nsp12; materials and methods), the self-NMPylation of nsp12 could not be detected (compare Figure 2B, lane 7, and Figure 1B), which довів ефективність (і кілька раундів) UMP перейшов з nsp12 на nsp9.
HCoV-229E nsp12-опосередкована UMPіляція nsp9.Ряд білкових субстратів (включаючи бичачий сироватковий альбумін, MBP-lacZα та ряд HCoV-229E nsps, мічених С-кінцевим His6, кодованим ORF1a), використовували для оцінки UMP-пілюючої активності HCoV-229E nsp12-His6⁺-опосередкованої білок.Інкубуйте білок з [α-32P] UTP протягом 10 хвилин за відсутності (A) або присутності (B) nsp12, як описано в матеріалах і методах.У верхній частині A і B показано SDS-поліакриламідний гель, забарвлений кумасі Brilliant Blue, а внизу A і B показані відповідні авторадіограми.Ліворуч наведено положення маркера молекулярної маси білка (у кілодальтонах).Положення nsp12-His6 (B, зверху) і радіоактивний сигнал, що спостерігався під час інкубації nsp12-His6 з nsp9-His6 (B, доріжка 7), також вказано, що вказує на те, що [α-32P]UMP до nsp9-His6 ( 12,9 кДа), що не спостерігалося для інших протестованих білків.
HCoV-229E NiRAN-опосередкована біохімічна та вірусологічна характеристика NMP-піляції nsp9.(A і B) Роль нуклеотидного косубстрату, який використовується в реакції.Nsp12-His6 і nsp9-His6 змішують та інкубують у присутності різних [α-32P] NTP у стандартному аналізі NMP-піляції.(A, вгорі) nsp9-His6, пофарбований кумасі, розділений SDS-PAGE.(A, внизу) Авторадіограма тієї ж ділянки гелю.(B) Відносна активність (середнє ± SEM) у присутності зазначеного нуклеотидного кофактора визначається з трьох незалежних експериментів.*P≤0,05.(C) Роль іонів металів.Показано стандартний тест на NMP-піляцію в присутності [α-32P] UTP та різних іонів металів, кожен з концентрацією 1 мМ.У верхній частині C показано nsp9-His6, забарвлене Кумасі, а в нижній частині C показана відповідна авторадіографія.Розмір міченого білка (у кілодальтонах) показано ліворуч від A і C. (D) Мутантна форма HCoV-229E nsp12-His6, що несе зазначену амінокислотну заміну, знаходиться в [α-32P]UTP, як описано в матеріалах і методах.Мічений радіоактивним ізотопом nsp9-His6, що утворюється в реакції NMP-пілювання, виявляється за допомогою зображення фосфорилювання (D, вгорі).Відносна активність порівняно з білком дикого типу (маса) показана в D, а нижня частина взята як середнє (±SEM) із трьох незалежних експериментів.Зірочки вказують на заміни неконсервованих залишків.(E) Титр вірусу в супернатанті культури клітин p1, отриманих через 24 години після інфікування, визначали за допомогою аналізу бляшок.Вказано заміни кодонів у домені NiRAN сконструйованого мутанта HCoV-229E (нумерація залишків базується на їх положенні в pp1ab).Мутант активного сайту RdRp з дефіцитом реплікації nsp12_DD4823/4AA використовувався як контроль.
Щоб отримати глибше розуміння активного центру NiRAN і визначити залишки, пов’язані з активністю nsp9-специфічної NMP-трансферази, ми провели мутаційний аналіз, в якому ми замінили консервативні залишки в мотивах NiRAN AN, BN і CN ( 16) Це Ala (додаток SI, малюнок S2).Крім того, вплив консервативних замін Arg на Lys або Lys на Arg було оцінено у двох випадках.В якості (негативного) контролю залишки, які не є або менше зберігаються в домені NiRAN коронавірусів та інших вкладених вірусів, замінюються на Ala. Заміна K4116A (у мотиві preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (мотив BN) і D4280A (CN) значно знижує або навіть усуває NMP-піляцію nsp9 через nsp12, тоді як білки з консервативними замінами (R4178K), K4116R) зберігають 60% і 80% своєї активності, що вказує на те, що послаблення обмежень на їх відповідній стороні ланцюгів є фізико-хімічно чутливим (Рис. 3D).Заміна кількох інших консервативних залишків E4145A, D4273A, F4281A та D4283A набагато менш шкідлива, а UMP-піляція nsp9 лише помірно знижена.Подібні результати були отримані в реакціях NMP-пілювання nsp9 за участю інших NTP (рис. 3D і додаток SI, рис. S3), підтверджуючи, що спостережувані ефекти на специфічні заміни амінокислот не залежать від типу використовуваного нуклеотидного косубстрату.Далі ми перевірили можливий вплив цих замін nsp12 на реплікацію коронавірусів у культурі клітин.З цією метою ми використали відповідні шаблони комплементарної ДНК (кДНК), клоновані в рекомбінантному вірусі коров’ячої віспи (23, 24), для транскрипції 5-7 клітин.Титрування потомства інфекційного вірусу, утвореного в цих клітинах, показало, що більшість мутантів HCoV-229E NiRAN неможливі (рис. 3E).Група нежиттєздатних вірусних мутантів включає альтернативи, які, як було показано, усувають або значно знижують активність трансферази NMP in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), але є дві інші альтернативи (K4116R, E4145A) 80 % зарезервований?Їх активність NMP-піляції in vitro свідчить про наявність додаткових обмежень.Подібним чином дві інші мутації (R4178K, F4281A), які спричинили помірне зниження активності NMP-піляції NiRAN in vitro, створили живі віруси, однак ці віруси значно зменшили титри шляхом реплікації.Відповідно до даних про активність in vitro, наведених на малюнку 3D, заміна чотирьох інших залишків, які не збереглися в коронавірусі та/або інших вкладених вірусах (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16), створила життєздатні віруси. Нащадки, незважаючи на наявність помірно знижений титр порівняно з вірусом дикого типу (рис. 3E).
Щоб дослідити, чи залежить NiRAN-опосередкована NMP-трансферазна активність від активного домену RdRp, два консервативних залишки Asp, які беруть участь у координації іонів двовалентних металів (11) у мотиві C RdRp, були замінені на Ala. Отриманий білок nsp12_DD4823/4AA зберігає його активність NMP-піляції nsp9, що вказує на те, що опосередкована nsp12 активність NMP-піляції nsp9 in vitro не потребує активності полімерази (Додаток SI, Рисунок S4).
Після встановлення nsp9-специфічної NMP-трансферазної активності для nsp12 ми спробували охарактеризувати аддукт NMP-nsp9 за допомогою мас-спектрометрії (MS).Повний білковий мас-спектр рекомбінантного HCoV-229E nsp9 показав пік при 12 045 Да (Малюнок 4A).Додавання nsp12 не змінило якості nsp9, вказуючи на те, що nsp12 і nsp9 не утворять стабільний комплекс за використовуваних умов (денатурація) (Рис. 4A).У присутності UTP і GTP вимірювання маси реакції, що містить nsp9 і nsp12 відповідно, показало, що маса білка UTP перемістилася на 306 Да, а маса білка GTP перемістилася на 345 Да, що вказує на те, що кожна молекула nsp9 зв’язує UMP або GMP (Малюнок 4) C і D).Існує припущення, що енергія, необхідна для NMP-піляції nsp9, опосередкованої NiRAN, надходить від гідролізу NTP і вивільнення пірофосфату.Хоча в цій реакції використовувався 10-кратний молярний надлишок nsp9 (мішень), ніж nsp12 (фермент), спостерігалося майже повне NMP-пілування nsp9, що вказує на те, що взаємодія між nsp12 і nsp9 є короткочасною, і nsp12 може NMP-пілувати більше nsp9 in vitro молекули.
Одиночне NMP-пілювання nsp9 у присутності nsp12 і UTP або GTP.Показано деконволюційний повний мас-спектр білка HCoV-229E nsp9 (додаток SI, таблиця S1) (AD).(A) сам nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 у присутності UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 у присутності GTP.
Для визначення залишків UMP nsp9, пілованих nsp12, nsp9-UMP розщеплювали трипсином.Аналіз даних за допомогою програмного пакету Byonic (Protein Metrics) показав UMP-пілування N-кінцевої амінокислоти.Це підтверджується вручну.Тандемний мас-спектр пептиду-попередника [UMP]NNEIMPGK (додаток SI, рис. S5A) виявив фрагмент при 421 m/z, що вказує на те, що UMP зв’язується із залишком 1 nsp9.
На N-кінці nsp9 Asn зберігається серед членів Orthocoronavirinae (додаток SI, рис. S6).За цих умов лише вільні первинні аміни можуть бути модифіковані пропілом (25).Тому пропілові групи можуть бути введені на обох кінцях.Екстраговані іонні хроматограми не NMP-пільованих пептидів показані в додатку SI, рис. S5B.Ця закономірність змінюється з використанням N-кінцевого N-кінцевого пептиду nsp9.У цьому випадку можна ідентифікувати лише C-кінцеві пропільовані пептиди, але N-кінцеві пропільовані пептиди та дипропільовані пептиди не ідентифікуються (Додаток SI, рис. S5C), що вказує на те, що UMP було перенесено на N-кінцевий первинний амін, щоб запобігти цьому групі від внесення змін.
Далі ми замінюємо (на Ala або Ser) або видаляємо консервативні залишки на N-кінці nsp9, щоб визначити специфічні для мішені обмеження.Based on our MS data showing that NiRAN forms an nsp9-NMP adduct with the primary amine of the N-terminal residue of nsp9, we hypothesized that nsp9 NMPylation requires the viral master protease (Mpro, nsp5) to release the nsp9 N-terminal from його поліпротеїновий попередник.Як показано на малюнку 5A (доріжка 3), нерозрізаний попередник nsp7-11 не позначений радіоактивним міченням nsp12.In contrast, if nsp7-11 is cleaved by recombinant nsp5 to release nsp9 (and other nsps) from the precursor, a radiolabeled protein that migrates with nsp9 is detected, confirming our conclusion that NiRAN and N- Selective formation of covalent nsp9-NMP adducts .Кінцевий первинний амін N-кінцевого Asn (позиція 3825 у pp1a/pp1ab).Цей висновок також підтверджується експериментами з використанням конструкції nsp9, яка містить один або два додаткових залишки на N-кінці.В обох випадках NiRAN-опосередковане UMPilation nsp9 було скасовано (Додаток SI, Рисунок S7).Далі ми виготовили білок з одним або двома залишками Asn, видаленими з послідовності пептиду 3825-NNEIMPK-3832 на N-кінці nsp9.В обох випадках UMP-піляція nsp9 була повністю заблокована (рис. 5B), надаючи додаткові докази того, що справжній N-кінець nsp9 діє як рецептор NMP.
Протеолітичний процесінг nsp9 і роль N-кінцевих залишків у опосередкованому nsp12 UMPilation.(A) nsp9 UMPylation вимагає вільного N-терміналу nsp9.Nsp7-11-His6 попередньо інкубують при 30 °C у буфері виявлення NMP-піляції, що містить UTP у присутності або за відсутності рекомбінантного Mpro (nsp5-His6).Через 3 години почніть аналіз NMP-піляції, додавши nsp12-His6, як описано в матеріалах і методах.Реакцію, що містить nsp5-His6 (доріжка 1) і nsp9-His6 (доріжка 2), використовували як контроль.Через 10 хвилин реакцію припиняли і реакційну суміш розділяли за допомогою SDS-PAGE.Білок забарвлювали кумасі блискучим синім (A, зверху).Попередник Nsp7-11-His6 і оброблений продукт, отриманий в результаті опосередкованого розщеплення nsp5-His6, показані праворуч.Будь ласка, зверніть увагу (через їх малий розмір), що nsp7 і nsp11-His6 не виявляються в цьому гелі, і реакція доповнюється nsp5-His6 (доріжки 1 і 4; положення nsp5-His6 позначено суцільним колом) або nsp9-His6 (доріжка 2) містить невелику кількість MBP (позначених відкритими кружками) як залишкові домішки, оскільки вони експресуються як злиті білки MBP (додаток SI, таблиця S1).(B) Варіант Nsp9-His6 не має одного або двох N-кінцевих залишків Asn (нумерація залишків відповідно до позиції в pp1a/pp1ab) і очищається та інкубується з nsp12-His6 і [α-32P] UTP.B, SDS-PAGE, пофарбований кумасі, показано вгорі, B, відповідна авторадіограма показана внизу.Положення маркера молекулярної маси (у кілодальтонах) показано зліва.(C) N-кінцеві консервативні залишки HCoV-229E nsp9-His6 були замінені на Ala або Ser, і таку саму кількість білка використовували в опосередкованій nsp12-His6 реакції UMPilation.Продукти реакції відокремлювали за допомогою SDS-PAGE і фарбували кумасси діамантовим блакитним (C, вгорі), а радіоактивно мічений nsp9-His6 виявляли за допомогою фосфоресцентної візуалізації (C, посередині).Використовуючи білок дикого типу (wt) як еталон (встановлений на 100%), відносну активність NMP-піляції (середнє значення ± SEM) розраховували з трьох незалежних експериментів.(D) Титри вірусу в супернатанті клітинної культури p1 клітин Huh-7, інфікованих клітинами Huh-7 дикого типу HCoV-229E, і мутантів, що несуть визначені амінокислотні заміни в nsp9, визначали за допомогою аналізу бляшок.Подвійний мутант DD4823/4AA з дефіцитом реплікації мотиву RdRp C використовували як негативний контроль.
N-кінець nsp9 (особливо позиції 1, 2, 3 і 6) дуже консервативний серед членів підродини Orthocoronavirinae (додаток SI, рис. S6).Щоб вивчити можливу роль цих залишків у nsp12-опосередкованій NMP-піляції nsp9, два послідовних залишки Asn на N-кінці nsp9 були замінені на Ala або Ser (окремо або в комбінації).Порівняно з nsp9 дикого типу, заміна N3825 на Ala або Ser призвела до більш ніж подвійного зниження опосередкованої nsp12 UMPilation (рис. 5C).Відповідно до нашого висновку, що NMP-піляція відбувається на N-кінцевому первинному аміні замість бічного ланцюга N-кінцевого залишку, ми спостерігали значне залишкове NMP-пілювання із заміною N3825A та N3825S.Цікаво, що якщо другий Asn замінюється на Ala або Ser, UMPіляція nsp9 знижується сильніше (більш ніж у 10 разів), тоді як заміна Ala в положеннях 3, 4 і 6 має лише помірний вплив на UMPіляцію nsp9 (рис. 2). ) .5C).Подібні результати були отримані за допомогою ATP, CTP або GTP (додаток SI, рис. S8).У сукупності ці дані вказують на ключову роль N2826 (позиція 2 у nsp9) у NMP-піляції nsp9.
In order to obtain additional evidence of the functional correlation between the N-terminus of nsp9 and NMPylation, we performed a multiple sequence alignment (MSA) of the nsp9 sequence of the Coronavirus family (varying between 104 and 113 residues) (SI Appendix, Figure S6).Найбільш масштабні зміни, включаючи делеції та вставки, спостерігалися в циклах між елементами вторинної структури nsp9, як визначено попередніми структурними дослідженнями (26–28).П'ять інваріантних залишків були знайдені в ланцюзі β і спіралі α С-кінцевої частини nsp9.Три інваріантні залишки складають мотив NNE N-кінця nsp9.Виявлено, що другий Asn цього мотиву є єдиним інваріантним залишком, який також поділяється гіпотетичним nsp9 віддаленого спорідненого коронавірусу жаби, і представляє вид Microhyla letovirus 1 у підродині Letovirinae Alphaletovirus.Збереження залишків в елементах вторинної структури nsp9 може бути раціоналізовано структурними міркуваннями для підтримки згортання або відомих властивостей зв’язування РНК.Однак це міркування, здається, не стосується збереження NNE, і до цього дослідження природа обмежень, які обмежують варіацію трипептидної послідовності, була повністю прихована.
Щоб визначити важливість NMP-піляції nsp9 і збереження NNE у реплікації коронавірусу, ми створили мутанти HCoV-229E, які несуть одиничні або подвійні заміни N-кінцевих залишків nsp9, що вказує на шкідливість NMP-піляції nsp9 in vitro.Перш ніж ми почнемо, ми спробуємо відповісти на питання, чи впливають ці заміни (біля сайту розщеплення nsp8|9) на протеолітичний процесинг С-кінцевої області pp1a.Набір поліпротеїнових конструкцій nsp7-11, що містять відповідні заміни на N-кінці nsp9, виробляли в E. coli та розрізали рекомбінантним Mpro.На протеолітичне розщеплення чотирьох сайтів (включаючи фланкуючий сайт nsp9) істотно не впливають будь-які введені заміни (додаток SI, рис. S9), за винятком структурних змін у цих білках, які перешкоджають Mpro-опосередкованому розщепленню nsp8|9 (або інше) веб-сайт.
Клітини Huh-7 трансфікували РНК HCoV-229E довжиною генома, що кодує заміни Ala або Ser у консервативних трипептидах NNE (N3825, N3826 і E3827) на N-кінці nsp9, показуючи, що більшість мутацій є фатальними.Нам вдалося врятувати вірус, замінивши Ser або Ala N-кінцевого Asn (N2835A або N2835S), але не вдалося відновити вірус за допомогою інших одинарних і подвійних мутацій у послідовності NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (Малюнок 5D).
Ці результати вказують на те, що реплікація коронавірусів у культурі тканин обмежена (така сама чи подібна), що обмежує природну мутацію сайтів NMP-піляції nsp9 в організмі та підтверджує ключову роль цієї відповіді в життєвому циклі коронавірусів.
В останній серії експериментів ми виробили С-кінцевий His6, мічений SARS-CoV-2 nsp12 і nsp9, і дві мутантні форми nsp12 у E. coli.Залишки активного центру в доменах NiRAN і RdRp були відповідно Використовуйте замість Ala (рис. 6A і додаток SI, таблиця S2).K4465 у SARS-CoV-2 nsp12 відповідає K4135 у HCoV-229E (додаток SI, рисунок S2), який виявився необхідним для активності NiRAN і реплікації HCoV-229E (рис. 3D і E).Цей залишок також відповідає залишку артеріального вірусу EAV nsp9 K94, який, як було раніше показано, необхідний для самопілювання NiRAN/самопілювання GMP (16).Як показано на малюнку 6B, SARS-CoV-2 nsp12 має активність трансферази UMP, використовуючи nsp9 як субстрат, тоді як мутант активного сайту nsp12_K4465A неактивний.Подвійна заміна в характерній послідовності SDD мотиву C RdRp не впливає на активність трансферази UMP (рис. 6B), що вказує на те, що активність RdRp не має прямого впливу на UMPilation nsp9.Подібні дані були отримані за допомогою CTP, GTP і ATP (додаток SI, рис. S10).Підсумовуючи, ці дані вказують на те, що NiRAN-опосередкована NMP-піляція nsp9 має консервативну активність у коронавірусах, що представляють різні роди підродини ортокоронавірусів.
NMP-піляція nsp9, опосередкована SARS-CoV-2 nsp12.(A) Пофарбований кумасі SDS-поліакриламідний гель, що демонструє рекомбінантний білок, використаний у тесті NMP-піляції.В якості контролю використовувався мутантний білок із заміщенням активного сайту в домені NiRAN (K4465A) і домені RdRp (DD5152/3AA) SARS-CoV-2 nsp12.Нумерація залишків базується на позиції в pp1ab.(B) Авторадіограма виявлення UMPylation з використанням nsp9-His6 і [α-32P]UTP як субстрату nsp12-His6 (дикий тип [wt] і мутант).Молекулярна маса (в кілодальтонах) міченого білка показана ліворуч.
Домени NiRAN, як правило, збережені в Nidovirales (16), що вказує на те, що вони каталізують ферментативні реакції, необхідні для реплікації Nidovirus.У цьому дослідженні ми змогли довести, що домен NiRAN коронавірусу переносить NMP (генерований з NTP) на nsp9, таємничий РНК-зв’язуючий білок, який бере участь у реплікації вірусу (26–29), щоб визначити його як природну мішень і партнер Коронавірус РТЦ.
Домен NiRAN має три мотиви послідовності (AN, BN і CN), які містять дуже невелику кількість залишків, які зберігаються у всіх родинах у монофілетичному, але високодиференційованому порядку Nidovirales (8, 16).Недавні дослідження показали, що вони структурно пов’язані з переважно неохарактеризованою сімейством протеїнкіназоподібних білків, які спочатку називалися сімейством SelO (17, 19, 22, 30, 31).Білки, пов’язані з SelO, мають кіназні складки, але не мають кількох консервативних залишків активного центру в класичних кіназах (22, 32).На підставі зворотної орієнтації молекул АТФ, зв’язаних з активним центром і стабілізованих специфічними взаємодіями, була висунута гіпотеза, яка згодом підтверджена, що SelO переносить АМФ (замість фосфату) до білкового субстрату (22), тоді як інший бактеріальний SelO-подібний білок YdiU має нещодавно було показано, що каталізує ковалентне приєднання UMP до залишків Tyr і His різних білкових субстратів (33).
Щоб підтвердити та розширити передбачення ймовірних залишків активного центру домену NiRAN коронавірусу, ми використали біохімічні методи та методи зворотної генетики для проведення аналізу мутацій у коронавірусі nsp12 (рис. 3D та додаток E та SI, рис. S3 і таблиця) S1â S4).Дані показують, що заміна HCoV-229E K4135, R4178 і D4280 на Ala усуває in vitro NMP-трансферазну активність і реплікацію вірусу в клітинній культурі (рис. 3D і додатки E і SI, рис. S3), підтверджуючи їх присутність у γ-фосфаті NTP (K4135, R4178) та координація іонів металу активного центру (D4280).Було показано, що заміна E4145A консервативного Glu в діапазоні вірусу пташиного гнізда, який, за прогнозами, стабілізує позицію K4135 (17), усуває реплікацію вірусу, але, як не дивно, активність збереглася в аналізі NMP-піляції in vitro (рис. 3D і E та додаток SI, малюнок S3 і таблиці S1–S4).Подібне спостереження було зроблено, коли відповідну заміну було введено в гомолог YdiU Salmonella typhimurium (E130A) (33).Взяті разом, ці дані підтверджують регуляторну функцію цього консервованого залишку, а не каталітичну функцію.
Заміна консервативного залишку Phe (F4281A) у діапазоні нестовірусу в домені HCoV-229E NiRAN (8) призвела до зниження активності NMP-піляції in vitro та значного зниження реплікації вірусу в культурі клітин (рис. 3D, E та SI) додаток, малюнок S3).Дані узгоджуються з важливою регуляторною функцією цього залишку, такою як гомологічний залишок Phe мотиву DFG, показаний раніше.У класичних протеїнкіназах він є частиною зв’язувальної петлі Mg2+ і допомагає зібрати та регулювати хребет???Необхідний для ефективної каталітичної активності (32, 34).Заміна Ala та Arg на залишки K4116 (у мотиві preAN), відповідно, усунула реплікацію вірусу та, як і очікувалося, мала різний вплив на активність трансферази NMP in vitro, залежно від введеного бічного ланцюга амінокислоти (Рис. 3D, E та SI, додатки). , малюнок S3).Функціональні дані узгоджуються зі структурною інформацією, вказуючи на те, що цей залишок встановив взаємодію з АТФ-фосфатом (17).У домені NiRAN інших сімейств вкладених вірусів позиція HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 займає Lys, Arg або His (8), що вказує на те, що функціональне обмеження цього специфічного залишку було послаблено.Заміна D4188A та D4283A усуває або сильно знижує активність ферменту та усуває реплікацію вірусу (рис. 3).Ці два залишки зберігаються у більшості (але не у всіх) вкладених вірусів (8), що вказує на важливу специфічну для родини, але, можливо, некаталітичну функцію.Ala заміни кількох інших залишків Lys і Asp (K4113A, D4180A, D4197A і D4273A), які не збереглися в Coronaviridae або інших родинах Nestioviridae (8), використовували як контроль.Як і очікувалося, ці заміни в основному прийнятні, з незначним зниженням активності ферментів і реплікації вірусу в деяких випадках (рис. 3 і додаток SI, рис. S3).Загалом, дані мутагенезу коронавірусу дуже узгоджуються з даними GMP і зворотної генетики EAV NiRAN-RdRp (16), в якому EAV nsp9 (ортолог nsp12 коронавірусу) залишок K94 (відповідає HCoV-229E K4135) виконує важливі функції), R124 (відповідає R4178), D132 (відповідає D4188), D165 (відповідає D4280), F166 (відповідає F4281).Крім того, дані мутагенезу HCoV-229E узгоджуються з даними зворотної генетики SARS-CoV, отриманими раніше, і розширені з ними (16), а також дуже подібні до тих, що спостерігаються для відповідного мотиву CN Phe-to-Ala мутанта SARS-CoV_nsp12. описаний фенотип -F219A і HCoV-229E_F4281A (рис. 3 D і E і додаток SI, рис. S3 і таблиця S1-S4).
Порівняно з ортологами EAV (16), які віддають явну перевагу UTP і GTP (у реакції самопіляції NMP), наше дослідження показує, що домен NiRAN коронавірусу (представлений HCoV-229E і SARS-CoV-2) може бути ефективно перенесено всі чотири НМП, хоча є невелика перевага для УМП (рис. 1 і 3).Відносно низька специфічність конкретного косубстрату NTP узгоджується з нещодавно зареєстрованою суперкомпозитною структурою SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13, у якій ADP-Mg2+ зв’язується з активним центром NiRAN, але не з аденіновою частиною. формування специфічних взаємодій (17).У нашому дослідженні тип нуклеотиду, який використовується в реакції NMP-пілювання, не має диференційованого впливу на активність мутантного білка (додаток SI, рис. S3), що вказує на те, що жоден із цих залишків не має тісного зв’язку зі зв’язуванням певної нуклеооснови.Структурну основу та потенційне біологічне значення різних ко-субстратних переваг NTP, що спостерігаються в доменах NiRAN коронавірусів та артеріальних вірусів, ще належить вивчити;вони можуть бути правдивими або можуть бути наслідком обмежень їхніх відповідних досліджень.Наразі не можна виключати, що потенційна активність NMPylator домену NiRAN артеріального вірусу (порівняно з раніше охарактеризованою активністю самоNMPylation) має іншу перевагу ко-субстрату, беручи до уваги, що подібність між артеріальним і коронавірусним вірусом Домен NiRAN досяг свого ліміту.Порівняння на основі послідовності (16).Порівняно з псевдокіназою SelO, яка використовує Mg2+ як кофактор, активність коронавірусу та артеріального вірусу NiRAN залежить від Mn2+ (16) (рис. 3C і додаток SI, рис. S1).Залежність від Mn2+ і очевидна перевага UTP є незвичайною властивістю білкових NMPylators і лише нещодавно була підтверджена в білку YdiU Salmonella typhimurium, який каталізує суворе Mn2+-залежне білкове шаперонне UMPylation для захисту клітин від індукції стресу Клітинний пул ATP ( 33).
Нещодавно описана структурна подібність між доменом NiRAN коронавірусу та клітинними протеїнкіназами (17, 19) забезпечує додаткову підтримку здатності NiRAN ковалентно зв’язувати NMP з іншими білками, про які ми повідомляли в цьому дослідженні.Ми зосередили наш пошук можливих мішеней NiRAN на білках, кодованих HCoV-229E ORF1a, які, як відомо, прямо чи опосередковано допомагають кодованій ORF1b репліказі RTC (12, 35).Наші експерименти надають переконливі докази ефективної та специфічної NMP-піляції nsp9 (рис. 2).Якщо цільовий білок використовується в молярному надлишку, який у 8-10 разів перевищує надлишок ферменту (nsp12), підтверджується, що nsp9 повністю (моно)NMP-ізований (рис. 4).Ми прийшли до висновку, що взаємодія між nsp12 і nsp9 є короткочасною і не утворює стабільний комплекс з nsp9 (за відсутності інших субодиниць RTC).Цей висновок підтверджується дослідженнями взаємодії білків на протеомі SARS-CoV (35).МС-аналіз ідентифікував первинний амін N-кінцевого залишку nsp9 як сайт NMP-пілювання (додаток SI, рис. S5).Утворення фосфорамідатного зв’язку та N-кінцевої аміногрупи відрізняє NiRAN-опосередковану NMP-піляційну активність від Pseudomonas syringae SelO-опосередкованої реакції AMPilation, яка каталізує утворення O-зв’язаного AMP у залишках Ser, Thr або Tyr Пептидний аддукт ( 22), а S. typhimurium YdiU утворює O-пов’язані (з Tyr) і N-зв’язані (з His) аддукти пептид-UMP.Обмежена інформація, доступна про сімейство білків SelO, вказує на те, що члени цього великого сімейства білків значно відрізняються за утворенням аддуктів пептид-NMP.Це цікаве спостереження, яке заслуговує на подальше вивчення.
Дані, отримані в цьому дослідженні, привели нас до гіпотези про те, що для NMP-пілювання nsp9 потрібен вільний N-кінець.У контексті реплікації вірусу це буде забезпечено протеолітичним розщепленням сайту процесингу nsp8|nsp9 у поліпротеїні реплікази pp1a, опосередкованим Mpro та pp1ab.У більшості коронавірусів різниця між цим специфічним сайтом (VKLQ|NNEI у HCoV-229E) та всіма іншими сайтами розщеплення Mpro коронавірусу полягає в тому, що Asn (а не інший невеликий залишок, такий як Ala, Ser або Gly) займає P1â???Розташування (36).Дані про розщеплення пептидів, отримані в ранніх дослідженнях, показали, що ефективність розщеплення сайту nsp8|nsp9 була нижчою, ніж ефективність інших сайтів, що вказує на те, що 1) цей специфічний сайт може відігравати регуляторну роль у своєчасній скоординованій обробці С-кінца область pp1a або 2) a Роль спеціального консервативного N-кінця nsp9 у реплікації вірусу (37).Наші дані (рисунок 5A) показали, що рекомбінантна форма nsp9, що несе справжню N-кінцеву послідовність, була ефективно NMP-ізована nsp12.N-кінцева фланкуюча послідовність була видалена за допомогою фактора Xa (nsp9-His6; додаток SI, таблиця S1) або Mpro-опосередкованого розщеплення (nsp7-11-His6; малюнок 5A та додаток SI, таблиця S1).Важливо, що нерозрізаний попередник nsp7-11-His6, що містить nsp9, продемонстрував стійкість до NMP-пілування nsp12, що узгоджується з нашими даними, вказуючи на те, що аддукт nsp9-NMP утворюється через N-кінцевий первинний амін (додаток SI, рис. S5) .Щоб отримати глибше розуміння специфічності субстрату NiRAN, ми зосередилися на суміжних N-кінцевих залишках nsp9.За відсутності інших білків вони є структурно гнучкими, що запобігає їх виявленню в неміченій формі nsp9 (26, 28, 38), що вказує на їх обмежену природну варіацію. Це пов’язано з важливою специфічністю послідовності (не пов’язаною з вторинною структурою) функція N-кінцевого фрагмента nsp9.Заміни Ala консервативних залишків у цій області (рис. 5C і D і додаток SI, рис. S8) показують, що N3826 необхідний для NMP-піляції nsp9 in vitro, тоді як заміни N3825A та E3827A призводять до зниження NMP-піляції, тоді як заміни M3829A та P3830A ні. .Очевидно, впливає на NMP-піляцію nsp9.Хоча заміна N-кінцевого Asn (N3825A, N3825S) має лише помірний вплив на NMP-піляцію nsp9 і реплікацію вірусу в культурі клітин (рис. 5C і D), делеція послідовності залишку Asn з N-кінцевого дипептиду 3825-NN доведено, що він смертельний для вірусів, що вказує на те, що один залишок Asn необхідний перед іншим залишком на N-кінці, переважно Asn, хоча здається, що заміна подібних залишків може бути частково допустимою (рис. 5B, C і D).Ми робимо висновок, що дипептид 3825-NN, особливо консервативний і важливий залишок N3826 у діапазоні коронавірусу (додаток SI, рис. S6), забезпечує правильне зв’язування та орієнтацію N-кінця nsp9 в активному центрі NiRAN.
Substituting Ala (E3827A) for the conserved Glu of all subfamilies retains nsp9 NMPylation in vitro but is lethal to viruses in cell culture (Figure 5C and D), indicating the additional function of this residue, for example, in key interactions (NMPylated or unmodified ) N-кінець nsp9 та інші фактори, що беруть участь у реплікації вірусу.Мутації Nsp9 не вплинули на протеолітичний процес nsp9 або будь-якого сусіднього nssp (39) (Додаток SI, рисунок S9), що вказує на те, що летальні фенотипи кількох спостережених мутацій nsp9 не були спричинені дисрегуляцією кінцевої зони pp1a протеолітичного процесу С. .
Наведені вище дані свідчать про те, що після Mpro-опосередкованої обробки сайту розщеплення nsp8|9 у pp1a/pp1ab N-кінець nsp9 може бути UMPiled (або частково модифікований іншим NMP).Крім того, відмінне збереження N-кінця nsp9 (включаючи сингулярні та інваріантні залишки Asn у сімействі коронавірусів) і зворотні генетичні дані, отримані в цьому дослідженні (рис. 3E і 5D), привели нас до висновку, що описана NMP-піляція nsp9 є біологічно пов’язаним і необхідним для реплікації коронавірусу.Функціональні наслідки цієї модифікації ще належить дослідити, наприклад, щодо описаної раніше (неспецифічної) активності зв’язування РНК nsp9 (немодифікована форма) (2628).N-кінцева NMP-піляція також може впливати на взаємодію nsp9 із субстратами білка чи РНК або на формування різних чотирирівневих збірок.Вони спостерігалися в структурних дослідженнях, і було підтверджено, що вони функціонально пов’язані з реплікацією коронавірусу, хоча особливо за відсутності цієї модифікації (26-ââ29, 40).
Хоча цільова специфічність домену NiRAN коронавірусу ще потребує більш детальної характеристики, наші дані показують, що специфічність цільової білка домену NiRAN коронавірусу дуже вузька.Хоча збереження ключових залишків активного центру (8, 16) у домені NiRAN усіх сімейств нідовірусів сильно підтримує активність консервативних NMPylator цих білків, ідентичність субстрат-зв’язуючих залишків кишені цього домену Консервація та збереження ще належить охарактеризувати , і може відрізнятися для різних сімейств Nidovirales.Так само ще належить визначити відповідні цілі інших вкладених вірусів.Вони можуть бути віддаленими ортологами nsp9 або інших білків, оскільки послідовності за межами п’яти доменів репліказ, які зазвичай зберігаються у вкладених вірусах, є менш консервативними (8), включаючи масив геномів між Mpro та NiRAN. Серед них nsp9 розташований у коронавірус.
Крім того, наразі ми не можемо виключити можливість того, що домен NiRAN має додаткові (включаючи стільникові) цілі.У цьому випадку варто згадати, що бактеріальні гомологи в цьому новому білку NMPylators (NMPylators) (30, 31), здається, мають «головні регулятори»?NMP модулює різноманітні клітинні білки, щоб регулювати або усувати їх подальшу діяльність, тим самим відіграючи роль у різноманітних біологічних процесах, таких як реакція клітинного стресу та окисно-відновний гомеостаз (22, 33).
У цьому дослідженні (рисунки 2 і 4 і Додаток SI, малюнки S3 і S5) ми змогли довести, що nsp12 переніс частину UMP (NMP) в одну (збережену) позицію в nsp9, тоді як інші білки не були модифіковані в nsp9. використовується За цих умов підтримується чітко визначена (а не вільна) специфічність субстрату.Відповідно до цього, порівняно з N-кінцевою NMP-піляцією nsp9, власна активність NMP-піляції nsp12 дуже низька, її виявлення вимагає більш тривалого часу авторадіографічного впливу, і використовується 10-кратне збільшення концентрації nsp12.Крім того, наш аналіз MS не зміг надати доказів NMP-піляції nsp12, що свідчить про те, що самоNMP-піляція домену NiRAN є (у кращому випадку) вторинною активністю.Однак слід зазначити, що інші дослідження надали попередні докази того, що статус самоампіляції бактеріального NMPylator може контролювати їх активність NMPylation на інших білкових субстратах (22, 33).Таким чином, необхідні додаткові дослідження для вивчення можливих функціональних ефектів активності самопіляції NMP, про які повідомляється для EAV nsp9 (16) і коронавірусу nsp12 (це дослідження), включаючи запропонований ефект шаперону на згортання С-кінцевого домену RdRp ( 16) ).
Раніше було розглянуто декілька гіпотез щодо можливих нижчих функцій нідовірусного домену NiRAN, включаючи РНК-лігазу, РНК-закриту гуанілаттрансферазу та праймінг-активність білка (16), але жодна з них не сумісна з доступними нижніми функціями.Інформація, отримана в наступних позиціях, є точно однаковою за часом без додаткових припущень.Дані, отримані в цьому дослідженні, найбільш узгоджуються з (але не можуть підтвердити), що домен NiRAN бере участь в ініціації білково-індукованого синтезу РНК.Раніше вважалося, що функція домену NiRAN в 5??Ці та інші дані не впливають на реакції кепування ²-РНК або лігування РНК.Тому, наприклад, вважається, що активний центр NiRAN включає консервативний Asp як загальну основу (D252 у Pseudomonas syringae SelO; D4271 у HCoV-229E pp1ab; D208 у SARS-CoV-2 nsp12) (Додаток SI, рис. 2 ).S2) (17, 22, 33), тоді як каталіз в АТФ-залежній РНК-лігазі та ферменті блокування РНК здійснюється ковалентним проміжним продуктом ензиму-(лізил-N)-NMP, який включає незмінений залишок Lys ( 41).Крім того, дивовижна заснована на послідовності специфічність NiRAN коронавірусу для консервативних білкових мішеней і послаблена специфічність для ко-субстратів NTP (надає перевагу UTP) протистоїть NiRAN-опосередкованому блокуючому ферменту або функціям, подібним до РНК-лігази.
Очевидно, що потрібна значна додаткова робота для перевірки та, якщо це доведено, детального уточнення можливої ролі nsp9-UMP (nsp9-NMP) у білково-індукованому синтезі РНК, що зв’яже кілька цікавих, але (поки що) звітів, про які повідомлялося раніше .Поодинокі спостереження.Наприклад, було встановлено, що кінець негативної ланцюга РНК коронавірусу починається з оліго(U) ланцюга (42, 43).Це спостереження узгоджується з ідеєю, що синтез РНК з негативним ланцюгом ініціюється зв’язуванням UMPiled форми nsp9 з хвостом poly(A) (тригери), чому може сприяти його зв’язування з РНК Активність та/або взаємодія з інший білок RTC.Частина UMP, надана nsp9, може бути використана як «праймер» для опосередкованого nsp7/8/nsp12 олігоуридилювання, використовуючи хвіст 3??²-poly(A) у геномній РНК або іншій послідовності, що містить олігонуклеотид (A). служить матрицею, подібно до механізму, встановленого для білка VPg пікорнавірусу (44).А якщо пропозиція «ненормативна»????Ініціація (індукованого білком) синтезу негативної ланцюга РНК забезпечує зв’язок із спостереженнями, вказуючи на те, що негативна ланцюгова РНК коронавірусу має UMP (замість UTP) на кінці (42), що вважається ознакою того, що нуклеїнова кислота Dicer розщеплює кінець, фосфорильований невідомою уридин-специфічною ендонуклеазою.Якщо буде підтверджено, ця гідролітична активність нуклеїнової кислоти може допомогти вивільнити олігомерну UMP-пільовану форму nsp9 з 5²-кінця негативного ланцюга, що зароджується.Можлива роль nsp9 у праймінгу білка також узгоджується з попередніми дослідженнями зворотної генетики, які показали, що nsp9 (і nsp8) критично та специфічно взаємодіють із консервативним цис-діючим елементом РНК біля 3-го кінця геному коронавірусу.45).Відповідно до цього звіту, ці попередні спостереження тепер можуть бути переглянуті та розширені шляхом подальших досліджень.
Таким чином, наші дані визначили специфічну активність власної вкладеної вірусної ферментної мітки, пов’язаної з RdRp на N-кінці.У коронавірусі ця нещодавно виявлена NiRAN-опосередкована активність UMPylator/NMPylator використовується для покладання на Mn2+ і суміжні залишки Asn і викликає утворення (низькоенергетичних) фосфорамідатних зв’язків з N-кінцевим первинним аміном.Завдяки опосередкованому Mpro розщепленню в місці розщеплення nsp8|9 мішень nsp9 може бути використана для NMP-піляції, що вказує на функціональний зв’язок між протеазою та доменом NiRAN, який поширюється на RdRp.Збереження ключових залишків в активному центрі NiRAN nsp12 і мішені nsp9 у поєднанні з даними, отриманими від двох коронавірусів, включаючи SARS-CoV-2, надає переконливі докази того, що NMP-піляція nsp9 є коронавірусом. Консервативні особливості також є ключовим кроком у реплікації вірусу.Наявні дані приводять нас до висновку, що конкретна роль NMP-пільованої форми nsp9 у білково-індукованому синтезі РНК є розумним сценарієм для коронавірусу та інших вкладених вірусів, і NiRAN також може націлюватися на інші неідентифіковані білки.Регулювати вірус.Взаємодія з господарем.Якщо буде підтверджено, участь білкових праймерів у синтезі вірусної РНК збільшить спорідненість послідовності доменів Mpro/3CLpro та RdRp між раніше виявленими коронавірусом і пікорнавірусоподібною супергрупою (9), які тепер об’єднані в нещодавно створені Пізонівірити ( 46) у категорії.
Наші дані також показують, що основні, селективні та консервативні активності ферментів, визначені в цьому дослідженні, можуть бути використані як мішені для противірусних препаратів.Сполуки, які перешкоджають зв’язуванню (і подальшій модифікації) консервативного N-кінця nsp9 в активному центрі NiRAN, можуть бути розроблені в ефективні та універсальні противірусні препарати, придатні для лікування коронавірусів тварин і людини з різних (під)родових інфекцій. , включаючи коронавірус SARS-CoV-2 і близькосхідний респіраторний синдром.
Кодуюча послідовність білка коронавірусу, отриманого в цьому дослідженні, була ампліфікована за допомогою RT-PCR з використанням РНК, виділеної з Huh-7, інфікованого HCoV-229E, або Vero E6, інфікованого SARS-CoV-2, і вставлена за допомогою стандартних процедур клонування.Вектор експресії pMAL-c2 (біологічна лабораторія Нової Англії) або pASK3-Ub-CHis6 (47) (додаток SI, таблиці S1 і S2).Заміни одиночного кодону були введені за допомогою сайт-спрямованого мутагенезу на основі ПЛР (48).Щоб отримати злитий білок MBP, клітини E. coli TB1 трансформували відповідною плазмідною конструкцією pMAL-c2 (додаток SI, таблиця S1).Злитий білок очищали амілозоафінною хроматографією та розщеплювали фактором Ха.Згодом C-кінцевий His6-мічений білок очищали методом афінної хроматографії з іммобілізованим Ni (Ni-IMAC), як описано раніше (49).Для отримання злитого білка убіквітину клітини E. coli TB1 використовували відповідну плазмідну конструкцію pASK3-Ub-CHis6 (додаток SI, таблиці S1 і S2) і плазмідну ДНК pCGI, що кодує убіквітин-специфічну С-кінцеву гідролазу 1 (Ubp1).Перетворення (47).С-кінцевий His6-мічений білок коронавірусу очищали, як описано раніше (50).
Тест на самопіляцію HCoV-229E nsp12-His6 проводили, як описано в EAV nsp9 (16).Коротше кажучи, nsp12-His6 (0,5 мкМ) містить 50 мМ 4-(2-гідроксіетил)-1-піперазинетансульфонової кислоти (HEPES)-KOH, рН 8,0, 5 мМ дитіотреїтол (DTT), 6 мМ MnCl2, 25 мкМ буфер, інкубуйте вказаний NTP і 0,17 мкМ відповідав [α32-P]NTP (3000 Кі/ммоль; Hartmann Analytic) при 30 °C протягом 30 хвилин.У всіх інших (стандартних) аналізах NMP-піляції nsp12-опосередкованої nsp9 NMP-піляції умови реакції регулюють таким чином: nsp12-His6 (0,05 мкМ) і nsp9-His6 (4 мкМ) у присутності 50 мМ HEPES-KOH (pH 8,0). ), 5 мМ DTT, 1 мМ MnCl2, 25 мкМ зазначеного NTP і 0,17 мкМ відповідного [α32-P]NTP.Після інкубування протягом 10 хвилин при 30°C реакційний зразок змішували з буфером для зразка SDS-PAGE: 62,5 мМ трис(гідроксиметил)амінометан HCl (pH 6,8), 100 мМ DTT, 2,5% SDS, 10% гліцерину та 0,005% бромфенолу. блакитний.Білок денатурували шляхом нагрівання при 90 °C протягом 5 хвилин і відокремлювали за допомогою 12% SDS-PAGE.Гель фіксують і фарбують розчином Coomassie Brilliant Blue (40% метанолу, 10% оцтової кислоти, 0,05% Coomassie Brilliant Blue R-250), знебарвлюють і піддають впливу фосфоресцентного екрана протягом 20 годин (для виявлення nsp12 від NMP-піляції) або (максимум) 2 години (для оцінки NMP-піляції nsp9).Тепловізор Typhoon 9200 (GE Healthcare) використовувався для сканування екрана, а ImageJ використовувався для аналізу інтенсивності сигналу.
Для МС-аналізу 1 мкМ nsp12-His6 і 10 мкМ nsp9 (без гексагістидинової мітки) використовували в аналізі NMP-піляції (додаток SI, таблиця S1), а також використовували підвищену концентрацію 500 мкМ UTP і GTP.Залежно від їх концентрації та очікуваної якості білка, систему Waters ACQUITY H-Class HPLC, оснащену колонкою MassPrep (Waters), використовували для знесолення від 1 до 10 мкл буферних білкових розчинів онлайн.Знесолений білок елююється в електророзпилюваний джерело іонів мас-спектрометра Synapt G2Si (Waters) через наступний градієнт буфера A (вода/0,05% мурашиної кислоти) і буфера B (ацетонітрил/0,045% мурашиної кислоти), і температура колонки становить 60 °C і швидкість потоку 0,1 мл/хв: ізократичне елюювання 5% A протягом 2 хвилин, потім лінійний градієнт до 95% B протягом 8 хвилин і підтримка 95% B ще 4 хвилини.
Виявляються позитивні іони з діапазоном мас від 500 до 5000 m/z.Glu-фібринопептид B вимірюється кожні 45 секунд для автоматичної корекції дрейфу маси.Використовуйте інструментальне програмне забезпечення MassLynx із розширенням MaxEnt1 для деконволюції середнього спектру після вирахування базової лінії та згладжування.
UMPilated HCoV-229E nsp9 розщеплювали шляхом додавання модифікованого трипсину рівня секвенування (Serva) та інкубували протягом ночі при 37 °C.Для знесолення та концентрування пептидів використовували спінову колонку Chromabond C18WP (номер частини 730522; Macherey-Nagel).Нарешті, пептид розчиняли в 25 мкл води, яка містила 5% ацетонітрилу і 0,1% мурашиної кислоти.
Зразки аналізували методом МС з використанням мас-спектрометра Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Найновіша наносистема ВЕРХ (Dionex), оснащена спеціально встановленим торцем 50 см??Колонка C18 RP 75 мкм, наповнена магнітними кульками 2,4 мкм (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH) Підключіться до мас-спектрометра онлайн через джерело наноспрею Proxeon;ввести 6 мкл розчину для розщеплення трипсину у внутрішній діаметр 300 мкм ×??1 см C18 PepMap колонка попереднього концентрування (Thermo Scientific).Використовуючи воду/0,05% мурашиної кислоти як розчинник, зразок автоматично захоплювали та знесолювали зі швидкістю потоку 6 мкл/хв.
Наступні градієнти вода/0,05% мурашина кислота (розчинник A) і 80% ацетонітрил/0,045% мурашина кислота (розчинник B) були використані для досягнення поділу триптичних пептидів при швидкості потоку 300 нл/хв: 4% B для 5 хвилин, потім 30 A лінійний градієнт до 45% B протягом хвилин і лінійне збільшення до 95% розчинника B протягом 5 хвилин.Підключіть хроматографічну колонку до нановипромінювача з нержавіючої сталі (Proxeon) і розпиліть елюент безпосередньо в нагрітий капіляр мас-спектрометра, використовуючи потенціал 2300 В. Оглядове сканування з роздільною здатністю 60 000 в мас-аналізаторі Orbitrap пов’язане із принаймні трьома скануваннями даних MS/MS, динамічно виключеними на 30 секунд, з використанням дисоціації, спричиненої зіткненням лінійних іонів, або дисоціації зіткнення з більшою енергією в поєднанні з виявленням орбітальної пастки, роздільна здатність становить 7500.
Час публікації: 3 серпня 2021 р